مقاله تخصصی ارزیابی کیفیت اسپرم در زنبورهای نر | قسمت دوم

مطالعه غلظت اسپرم همچنین ممکن است برای ارزیابی کیفیت تولیدمثلی ملکه، از طریق تخمین تعداد اسپرم های ذخیره شده در اسپرماتکا اعمال شود. این یک پارامتر مهم مربوط به طول عمر ملکه است، زیرا زمانی که ذخیره اسپرم تمام می شود، شروع به گذاشتن تخم های بارور نشده  مینمایند که به زنبورهای نر بدون سرنشین تبدیل می شوند و در این زمان ملکه کلنی به طور کلی با یک ملکه جوان جایگزین می شوند.

عوامل مؤثر بر توانایی تولید مثل زنبورهای نر | قسمت دوم

بیشترین معیار مورد استفاده در ارزیابی کیفیت تولید مثل ملکه جوان، در نظر گرفتن آستانه 3 میلیون اسپرم ذخیره شده در اسپرماتکا برای تشخیص کیفیت تلقیح است. نسبت ملکه های ضعیف تلقیح شده (کمتر از 3 میلیون اسپرم) در مطالعات مختلف بین 13.6% و 19.0% بوده است.شیوه های زیستی و غیرزیستی و همچنین مدیریتی می تواند بر کیفیت تلقیح ملکه تأثیر بگذارد. تعداد اسپرم در اسپرماتکا به طور منطقی با افزایش سن ملکه کاهش می یابد.

3.4 » تحرک اسپرم
اگرچه تحرک اسپرم یکی از پرکاربردترین پارامترها برای تعیین کیفیت اسپرم در پستانداران است ، در زنبور عسل کمتر مورد توجه و ارزیابی قرار گرفته است. با این حال تحرک اسپرم یک پیش نیاز برای مهاجرت اسپرم به اسپرماتکای ملکه و لقاح بعدی تخمک است.

در واقع نشان داده شده است که تحرک اسپرم با شاخص‌های عملکرد اسپرم در ملکه‌های تلقیح شده نسبت به سایر آزمایش‌های کیفیت اسپرم ، از جمله سنجش زنده‌مانی، ارتباط قوی‌تری دارد .بیشتر تلاش‌ها برای ارزیابی این پارامتر در زنبور عسل بر اساس ایجاد نمره 4 تا 6، با توجه به درصد سلول‌های متحرک برآورد شده است. در مطالعات اخیر تحرک اسپرم با برخی از شاخص های گاه به گاه نوع حرکت ، بیشتر به عنوان درصد سلول های متحرک بیان شده است.

تا کنون به دلیل مشکلات در شناسایی سر اسپرم، امکان توسعه تجزیه و تحلیل تحرک اسپرم به کمک کامپیوتر در زنبورهای نر وجود نداشته است. علاوه بر این اسپرم زنبور عسل از الگوهای حرکتی معمولی اسپرم پستانداران پیروی نمی کند. اسپرم های زنبور نر تمایل دارند در حالی که در یک الگوی نسبتا دایره ای پیروی می کنند، به سرعت حرکت کنند.

یک کنترل دقیق بر روی عواملی که به طور بالقوه بر تحرک اسپرم تأثیر می گذارند به منظور به دست آوردن نتایج قابل اعتماد ضروری است و نیاز به استانداردسازی در این موضوع وجود دارد. متداول ترین روش مورد استفاده برای ارزیابی تحرک اسپرم در زنبورهای نر استفاده از لام های پوششی با یا بدون انکوباسیون نمونه قبل یا بعد از بارگذاری آن در محفظه است.

در مطالعه اخیر ما نشان دادیم که انتخاب محفظه مشاهده و رقیق‌کننده مورد استفاده تأثیر قابل‌توجهی بر نتایج تحرک دارد و پوشش‌های اسلاید سنتی منع مصرف دارند. به نظر می‌رسید که محفظه‌های یکبار مصرف خاص ، نتایج قابل اعتمادی با اثرات ناچیز بر پارامترهای تحرک اسپرم می‌دهند، حتی زمانی که اندازه‌گیری مدت طولانی پس از بارگذاری محفظه یا استفاده از محیط‌های بدون پروتئین انجام می‌شد.

اگر اسپرم در محیط های حاوی 2% BSA رقیق شود، استفاده از اتاقک Makler نیز ممکن است نتایج قابل اعتمادی را ارائه دهد. حداقل زمان سپری شده 5 دقیقه بین بارگذاری محفظه و ارزیابی حرکت اسپرم برای زنبورهای نر توصیه شد. رقیق کننده مورد استفاده برای ارزیابی تحرک اسپرم نرهای زنبور عسل نیز ممکن است تأثیر قابل توجهی بر نتایج داشته باشد.

در نهایت باید در نظر گرفت که بعید است ، مطالعه آزمایشگاهی حرکت شنای آزاد اسپرم‌های زنبور نر در وضعیت in vivo را منعکس کند، زیرا برخی الگوهای ضربان تاژک ممکن است توسط محدودیت‌های مکانیکی در داخل دستگاه تناسلی ایجاد شوند.

در این مطالعه پیشنهاد شد که الگوی حرکت مارپیچ دوگانه اسپرم حشرات ممکن است سازگاری با حرکت در مجاری باریک باشد، و این امکان وجود دارد که موج آکسونم در برابر دیواره مجرا به جای مایع اطراف عمل کند و منجر به خزیدن شود. حرکت به جای شنا این نشان می‌دهد که استفاده از دستگاه‌های مبتنی بر میکروکاپیلاری خاص ممکن است در مطالعه تحرک اسپرم در این گونه مورد علاقه باشد.

3.5 » مورفولوژی اسپرم
بر خلاف مورد پستانداران که ارزیابی مورفولوژی اسپرم یک وظیفه اساسی تجزیه و تحلیل مایع منی است، مطالعات بسیار کمی وجود اسپرم‌های غیرطبیعی مورفولوژیکی را در منی زنبور عسل ارزیابی کرده‌اند. اشکال مختلف دم نابجا، از جمله اشکال پیچ خورده، فرسوده و دو سر، گهگاه در زنبورهای نر توصیف شده است.

این ممکن است به همگنی بیشتر اشکال اسپرم در این گونه نسبت داده شود، اگرچه در تجربه نویسندگان، وجود اشکال غیرطبیعی ممکن است در شرایط خاص، مانند پس از روش‌های انجماد و ذوب افزایش یابد. در واقع سرهای غیرطبیعی اسپرم تنها در اسپرم‌های مرده پس از انجماد در نیتروژن مایع توصیف شده است.

با توجه به مورفومتری اسپرم، طول اسپرم کل و جزئیات نیز گهگاه به عنوان یک صفت کیفیت اسپرم گنجانده شده است، که در مطالعه اخیر تفاوت های قابل توجهی بین آغاز و پایان فصل تولید مثل را نشان می دهد.

3.6 » زنده ماندن اسپرم (یکپارچگی غشای پلاسما)
یکپارچگی غشای پلاسمایی یکی از رایج ترین پارامترهای کیفیت اسپرم ارزیابی شده برای تجزیه و تحلیل مایع منی در زنبور عسل است، زیرا از دست دادن یکپارچگی این لایه مرزی خارجی نازک با زنده ماندن اسپرم ناسازگار در نظر گرفته می شو.

روش‌های ارزیابی وضعیت پلاسمالما بر اساس افزایش نفوذپذیری غشاهای آسیب‌دیده به مواد مختلف، مانند لکه‌ها یا پروب‌های فلورسنت است .رایج ترین فلوروکروم مورد استفاده برای رنگ آمیزی سلول های اسپرم مرده پروپیدیوم یدید (PI) است. یک غشای پلاسمایی دست نخورده نسبت به PI نفوذ ناپذیر است، اما این ماده می تواند از غشاهای آسیب دیده عبور کند، به DNA متصل شود و فلورسانس قرمز روشن در هسته اسپرم مرده منتشر کند.

اغلب با یک رنگ دوم مانند SYBR-14، Hoechst 33342 یا نارنجی آکریدین ترکیب می شود که می تواند از غشای پلاسمایی سالم سلول های اسپرم زنده عبور کند، و همچنین میل ترکیبی به DNA داشته و رنگ سبزی ساطع می کند SYBR-14، نارنجی آکریدین ، یا آبی (Hoechst 33342) فلورسانس در سلول های زنده.

یک استراتژی جایگزین استفاده از محلول های هیپواسموتیکتست تورم هیپواسموتیک،  HOST  است که ممکن است اطلاعات ارزشمندی در مورد وضعیت غشای پلاسمایی ارائه دهد. این تکنیک بر اساس ارزیابی پیچ خوردگی دم مرتبط با تجمع آب در اسپرم با غشاهای پلاسمایی سالم است.

روش‌های دیگر مبتنی بر فعالیت آنزیمی سلول نیز گهگاه در زنبور عسل برای ارزیابی زنده‌مانی استفاده شده است ، شمارش دستی سلول‌های اسپرم زنده و مرده در زیر میکروسکوپ فلورسانس پس از رنگ‌آمیزی با SYBR-14/PI ، روشی است که اغلب در مقالات برای ارزیابی زنده‌مانی اسپرم در زنبور عسل توصیف شده است (جدول 2 ) .

فن‌آوری‌های دیگر، مانند فلوسیتومتری و تجزیه و تحلیل تصویر نیز پیاده‌سازی شده‌اند که امکان ارزیابی سریع‌تر این پارامتر را فراهم می‌کند.نتایج زنده ماندن اسپرم در انزال زنبورهای نر بسیار متغیر است و در مطالعات مختلف بین 55 تا 99 درصد متغیر را نشان داده است. ( جدول 2 ) در یک بررسی گام به گام، کاهش حدود 10٪ از زنده ماندن اسپرم در انتقال اسپرم از وزیکول های اسپرم زنبورهای نر (98.1٪) به مجرای تخمدان جانبی ملکه (88.7٪) توصیف شده است.

این کاهش به طور طبیعی در مرحله دوم از بین رفتن اندوفالوس و در هنگام تزریق مایع منی به مجرای تخمک جانبی ملکه رخ می دهد و به افزایش فشار روی اسپرم در این مراحل نسبت داده شده است. زنده ماندن اسپرم همچنین ممکن است با توجه به سن زنبور نر ، تغذیه ، شیوه های مدیریتی ، عوامل محیطی و قرار گرفتن در معرض حشره کش ها و کنه کش ها متفاوت باشد.

تأثیر مخلوط کردن نمونه‌های اسپرم از زنبورهای نر متعدد بر زنده‌مانی اسپرم بحث ‌برانگیز است. در برخی از مطالعات این روش هیچ تاثیری بر زنده ماندن اسپرم نداشت. با این حال رقیق شدن اسپرم در این مطالعات ممکن است اثر مضر احتمالی اسپرم از نرهای مختلف  بر بقای اسپرم را کاهش دهد.

در مطالعات دیگر اختلاط نمونه های منی تأثیر منفی بر بقای اسپرم داشت ، Collins و Donoghue مشاهده کردند که فرآیند پردازش مایع منی باعث ایجاد استرس فیزیکی بیشتری بر روی اسپرم در منی جمع شده نسبت به انزال های فردی می شود که می تواند زنده ماندن کمتر مشاهده شده را توضیح دهد.

در اسپرم از وزیکول‌های منی جمع‌آوری شد و با محتوای غدد جانبی سایر نرها مخلوط شد، که تأثیر منفی بر زنده‌مانی اسپرم را نشان داد.پس از ذخیره سازی در اسپرماتکا ملکه، در مطالعات مختلف بین 20 تا 100 درصد، با میانگین ها بین 80 تا 98 درصد زنده ماندن اسپرم ممکن است بسیار متغیر باشد. از دست دادن پیشرونده زنده ماندن اسپرم با افزایش سن ملکه نیز توصیف شده است.

3.7 » صداقت آکروزومی
در طی تخمگذاری ، ملکه تعداد کمی اسپرم را از اسپرماتکا آزاد می کند که از طریق میکروپیل ها وارد تخم می شود و در آنجا با غشای ویتلین مواجه می شوند. سپس با واکنش آکروزوم ، آنزیم های لیتیک را آزاد می کند که به نفوذ غشای ویتلین برای بارور کردن تخمک کمک می کند.

یکپارچگی آکروزوم اسپرم معمولاً با استفاده از لکتین های نشاندار شده با فلورسنت ، پروتئین های گیاهی که به طور خاص به برخی از گلیکوپروتئین های آکروزومی متصل می شوند، ارزیابی می شود. در زنبور عسل، تنها مطالعه‌ای که ، از رنگ‌آمیزی لکتین Pisum sativum agglutinin (PSA) استفاده می‌کند ، این موضوع ارزیابی می شود و روی اسپرم‌های ثابت و مرده، با آکروزوم‌های فلورسنت کامل سالم و آکروزوم‌هایی با رنگ‌آمیزی فلورسنت پایین یا تکه‌ای به‌عنوان آسیب دیده انجام می شود.

یک نقطه ضعف PSA این است که نسبت به سایر لکتین ها، مانند Arachis hypogaea آگلوتینین (PNA) اختصاصیت کمتری به ناحیه آکروزوم نشان می دهد . علاوه بر این PSA  میل ترکیبی به زرده تخم مرغ دارد که معمولاً در رقیق‌کننده‌های انجماد اسپرم نرها استفاده می‌شود و به طور غیر اختصاصی به سطح اسپرم متصل ‌شده و در نتیجه وضعیت آکروزومی ممکن است به اشتباه ارزیابی شود .

نیاز به تحقیقات بیشتری در مورد یکپارچگی آکروزومی در زنبور عسل وجود دارد. استفاده از فلوروکروم های جدید و روش ها باید ارزیابی شود. در پستانداران، تعیین وضعیت آکروزومی در اسپرم زنده با استفاده از فلوسیتومتری یا میکروسکوپ فلورسانس نسبتاً رایج است

. این روش مبتنی بر این واقعیت است که لکتین ها پروتئین های بزرگی هستند که نمی توانند به غشای آکروزوم دست نخورده نفوذ کنند و در نتیجه فلورسانس نشان دهنده اختلال آکروزوم یا واکنش آکروزوم است و عدم وجود فلورسانس نشان دهنده یک آکروزوم دست نخورده است.

3.8 » عملکرد میتوکندری اسپرم (پتانسیل غشای میتوکندری)
اسپرماتوزواها برای انجام عملکردهای مختلف خود به انرژی نیاز دارند و آنها عمدتاً می توانند ATP را از طریق مسیرهای فسفوریلاسیون گلیکولیتیک و اکسیداتیو (OXPHOS) بدست آورند. شواهد فزاینده ای وجود دارد مبنی بر اینکه میتوکندری ها نقش اساسی در تنظیم عملکرد و طول عمر اسپرم، حداقل در پستانداران، ایفا می کنند.

میتوکندری OXPHOS بسترهای انرژی اولیه را برای حرکت سلول های اسپرم فراهم می کند ، با این حال در حشرات، نقش مشتقات میتوکندری به عنوان اندامک های تولید کننده انرژی توسط چندین مطالعه زیر سوال رفته است، اگرچه فرض شده است که آنها نقش بیومکانیکی مهمی در تحرک اسپرم دارند .

عملکرد میتوکندری معمولاً با پتانسیل غشایی آن ارزیابی می شود. در زنبور عسل، تنها مطالعه ای است که عملکرد میتوکندری اسپرم را با استفاده از پروب رودامین 123 (R123) از طریق فلوسیتومتری ارزیابی کرده است. این یکی از اولین رنگ های مورد استفاده در پستانداران بود که در میتوکندری انباشته می شود که فلورسانس سبز ساطع می کند که شدت آن بسته به تعداد میتوکندری های عملکردی متفاوت است . معایب این کاوشگر حساسیت کم و زمان خاموش شدن سریع آن در مقایسه با کاوشگرهای اخیراً توسعه یافته مانند tetrachloro  یدید (JC-1) یا رنگ های خاص  MitoTracker  نیاز به تحقیقات بیشتر در مورد عملکرد میتوکندری اسپرم در زنبور عسل وجود دارد و استفاده از رنگ‌های جدید مانند JC-1 و MitoTracker ممکن است در این کار کمک کند ، دارد.

3.9 » تکه تکه شدن  DNA
با توجه به اهمیت انتقال دقیق اطلاعات ژنتیکی به فرزندان، چندین روش برای تشخیص DNA آسیب دیده در اسپرم رواج یافته است . این روش ها شامل سنجش ساختار کروماتین اسپرم  (SCSA)، تست ترانسفراز ترمینال dUTP Nick-end labeling (TUNEL) و تست پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD) است.

TUNEL در زنبور عسل برای تعیین کمیت شکستگی DNA ناشی از روش انجماد مورد سنجش قرار گرفته است، اگرچه هیچ افزایش واضحی در مقایسه با نمونه‌های اسپرم تازه مشاهده نشد . با استفاده از تست  SCD، تکه تکه شدن DNA کمتری در اسپرم ذخیره شده در اسپرماتکا نسبت به انزال زنبورهای نر مشاهده شد.همین تکنیک همچنین برای نشان دادن اینکه عفونت N. ceranae باعث آسیب DNA اسپرم در نبورهای نر می شود استفاده شد.

3.10 » Sperm Apoptosis
اسپرم ممکن است ویژگی های خاصی از سلول های سوماتیک آپوپتوز مانند قطعه قطعه شدن DNA ، جابجایی فسفاتیدیل سرین (PS) ، اختلال در میتوکندری یا حضور کاسپازهای فعال، همانطور که در پستانداران [117] توضیح داده شده است ، را نشان دهد.

از دست دادن عدم تقارن غشای پلاسمایی، به ویژه انتقال فسفاتیدیل سرین (PS) از درونی به بیرونی در اسپرم های بدون سرنشین با رنگ آمیزی انکسین V، همراه با فلوروکروم 7-آمینواکتینومایسین D (7-ADD) برای شناسایی سلول های مرده مطالعه شده است ، با این حال نویسندگان توضیح دادند که آپوپتوز در نمونه‌های اسپرم با استفاده از این ترکیب فلوئوروکروم مشاهده نشد.

 3.11 » اثر استرس

3.11.1 » استرس اکسیداتیو
از دست دادن هموستاز ردوکس در اسپرم ممکن است استرس اکسیداتیو ایجاد کند که ممکن است اثرات مضری بر اسپرم از جمله پراکسیداسیون لیپیدی غشاها و آسیب DNA داشته باشد.

در واقع اسپرم‌ها نسبت به سلول‌های سوماتیک ، بیشتر مستعد استرس اکسیداتیو هستند، زیرا حاوی سیتوپلاسم کاهش‌یافته با آنتی‌اکسیدان‌های کمی هستند و غشای پلاسمایی آن‌ها غنی از اسیدهای آزاد غیراشباع است که بسیار مستعد پراکسیداسیون هستند. علاوه بر این متابولیسم سلولی بالای اسپرم که برای به دست آوردن حرکت تاژک لازم است، رادیکال های آزاد تولید می کند. این فرآیند ممکن است با برخی درمان ها، مانند رقیق سازی و انجماد، تشدید شود .

اکسیداتیو از طریق تجزیه و تحلیل گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) به دلیل بی‌ثباتی، عمر کوتاه واسطه‌های و این واقعیت که اسپرم‌ها ذاتاً ROS تولید می‌کنند، تعیین مستقیم استرس بسیار چالش برانگیز است . اندازه گیری ظرفیت دفاعی اسپرم در برابر آسیب اکسیداتیو و پیامدهای استرس اکسیداتیو لیپوپراکسیداسیون غشاها و آسیب DNA جایگزین های بهتری به نظر می رسد.

برخی از مطالعات اخیر روی زنبور عسل که در آن پتانسیل کاهش سلول و فعالیت سوپراکسید دیسموتاز (SOD)تجزیه و تحلیل شده ممکن است با توجه به دانش ما در گروه اول قرار گیرند. هیچ مطالعه ای برای ارزیابی پراکسیداسیون لیپیدی غشای اسپرم زنبورهای نر وجود ندارد. این تجزیه و تحلیل ممکن است با استفاده از پروب های بور-دی پیرومتن (BODIPY) یا آنتی بادی های خاص علیه پراکسیدهای لیپیدی انجام شود.

3.11.2 »  پاسخ به استرس القایی
پاسخ اسپرم به انواع مختلفی از استرس القایی، مانند استرس حرارتی ،  اکسیداتیو یا استرس اسمزی ، به عنوان پارامتر کیفیت اسپرم در پستانداران استفاده شده است. در زنبور عسل تحمل اسپرم نرها در برابر استرس اسمزی و pH نیز مورد ارزیابی قرار گرفته است و ارتباطی با تعداد اسپرماتی که پس از هوش مصنوعی به اسپرماتکا می‌رسند، یافت می‌شود .

3.12 » سنجش های بیوشیمیایی
علاوه بر مطالعات فوق الذکر مربوط به ظرفیت آنتی اکسیدانی، سنجش های بیوشیمیایی دیگری مانند کمی سازی محتوای آدنوزین تری فسفات (ATP) و نشت آنزیم از سیتوزول و میتوکندری نیز گاهی برای تعیین کیفیت اسپرم در زنبور عسل استفاده می شود. ATP منبع اصلی انرژی است که توسط اسپرم برای فعالیت متابولیک و تحرک استفاده می شود. با توجه به ارتباط آن با تحرک اسپرم، ممکن است در ابتدا استدلال شود که افزایش غلظت ATP ممکن است نشان دهنده کیفیت بهتر اسپرم باشد. با این حال افزایش متابولیسم پرانرژی می‌تواند با تولید ROS منجر به آسیب‌های اکسیداتیو شود و افزایش سطح ATP نه تنها به دلیل افزایش متابولیسم بلکه به دلیل کاهش مصرف ATP است که در نتیجه تحرک اسپرم کاهش می‌یابد.

آزمایش‌های بیوشیمیایی برای تعیین کمیت نشت آنزیم‌های اسپرم پس از رقیق‌سازی و انجماد یا ذوب شدن ممکن است به عنوان نشانگر آسیب سلول‌های اسپرم استفاده شوند. یک همبستگی منفی معنی‌دار بین نشت آنزیم گلوکز 6-فسفات ایزومراز (GPI) از سلول‌های آسیب‌دیده و تعداد اسپرم‌هایی که پس از AI با منی منجمد شده به اسپرم می‌رسند، در زنبور عسل توصیف شده است.

3.13 » ارزیابی کیفیت اسپرم چند پارامتری اندازه‌گیری چند پارامتر به طور همزمان، سلول به سلول، ممکن است امکان توسعه آزمایش‌های کیفی قوی‌تر را فراهم کند و ممکن است احتمالات تحقیق را گسترش دهد. امروزه با توجه به در دسترس بودن طیف گسترده ای از پروب های فلورسنت، میکروسکوپ های فلورسنت چند کاناله و سیتومترهای چند لیزری، آزمایش های چندپارامتری مختلفی ممکن است ایجاد شود. در حقیقت ترکیبات متعددی در پستانداران توصیف شده است و احتمالاً روش‌های مشابهی در آینده نزدیک در زنبور عسل توسعه خواهد یافت.

3.14 » آلودگی اسپرم
در نهایت آلودگی به میکروارگانیسم ها با توجه به اهمیت آن از نظر حفظ اسپرم و باروری و امکان انتقال بیماری ها و عفونت ها به ملکه باید به عنوان یکی از جنبه های مهم کیفیت اسپرم در نظر گرفته شود.

به عنوان مثال نشان داده شده است که نمونه‌های اسپرم آلوده به باکتری، میانگین زنده‌مانی  کمتری نسبت به نمونه‌های غیرآلوده داشتند . اسپرم همچنین ممکن است حاوی هاگ ها و ویروس های نوزما باشد که به طور بالقوه می توانند بیماری ها را به ملکه منتقل کنند. با توجه به اندازه نسبتاً بزرگ اسپورهای نوزما (تقریباً 4.4 × 2.2 میکرومتر ، ممکن است حضور آنها در هنگام ارزیابی سایر پارامترهای کیفیت اسپرم به صورت میکروسکوپی بررسی شود.

 4 »  نتیجه گیری ها
مطالعه کیفیت اسپرم در زنبور عسل کاربردهای بالقوه و علاقه تحقیقاتی زیادی دارد. با این حال چندین جنبه از فیزیولوژی و کیفیت اسپرم زنبورهای نر هنوز نامشخص است و تحقیقات بیشتری در مورد این موضوع مورد نیاز است. از این نظر توسعه روش‌های پیچیده‌تر و عینی‌تر، مانند تجزیه و تحلیل اسپرم به کمک کامپیوتر، استفاده از رنگ‌های فلورسنت جدید و توسعه آزمایش‌های چندپارامتری همراه با تکنیک‌های فلوسیتومتری و آنالیز تصویر در این کار کمک می‌کند.