شیوع فروپاشی کلنی‌ زنبورعسل و ارتباط آن با آلودگی به گونه‌های نوزما

مقدمه

در سال‌های اخیر جمعیت بسیاری از گونه‌های گرده‌افشان کاهش داشته است، تعدادی از گونه‌ها منقرض و گونه‌های بیشتری در معرض آسیب هستند . کاهش جمعیت گرده‌افشان‌ها به‌ویژه زنبورعسل علاوه بر این‌که منجر به کاهش تولیدات کشاورزی می‌شود ، تهدیدی جدی برای گونه‌های گیاهی و تنوع زیستی در بسیاری از مناطق جهان نیز هست . بنابراین کاهش جمعیت کلنی‌های زنبورعسل که اغلب گسترده و قابل توجه هستند، پژوهش روی سلامت زنبوران را سرعت بخشیده است .
کاهش کلنی‌های زنبورعسل در مقیاس وسیع برای صنعت زنبورداری جدید نیست، از سال 1869 میلادی گزارش‌های بین‌المللی تلفات غیر معمول موجود است؛ در برخی از آن‌ها توصیف کاهش کلنی مشابه مواردی است که در چندسال اخیر گزارش شده است. کاهش قابل توجه زنبورعسل در گذشته با نام بیماری می(May Disease) ، ناپدید شدن (Disappearing Disease) و بیماری سقوط(Fall dwindle Disease) گزارش شده است، برای مثال در بیماری می که در سال‌های 1891 و 1896 میلادی در ایالت کلرادو امریکا اتفاق افتاد؛ دسته‌هایی از زنبوران به‌طور کامل ناپدید شدند یا در مدت زمان کوتاهی جمعیت آن‌ها به‌طور قابل ملاحظه‌ای کاهش یافت .
در سال‌های اخیر بسیاری از کلنی‌های مفقود شده با عنوان «ناپدید شده» گزارش شدند، این کلنی‌ها دارای تعداد کمی زنبور زنده یا بدون زنبور بودند . این پدیده در آمریکا اختلال فروپاشی کلنی (Colony Collapse Disease) و در اروپا سندرم کاهش کلنی زنبورعسل (Colony Depopulation Syndrome) نامیده شد.
آنچه امروزه فروپاشی کلنی نامیده می‌شود برای نخستین بار در سال 2006 میلادی توسط یک زنبوردار به‌نام Dave Hackenberg ساکن فلوریدا گزارش شد . پس از آن تا سال 2007 میلادی، بیش از 22 ایالت اختلال فروپاشی کلنی را گزارش کردند و برخی زنبورداران تا 95 درصد کندوهای خویش را از دست دادند. روند افزایش فروپاشی کلنی تا سال 2008 میلادی ادامه داشت؛ به‌طوری که 35 ایالت، این اختلال را گزارش کردند .
فروپاشی کلنی‌ها با مجموعه‌ی گسترده‌ای از علائم شامل ناپدید شدن ناگهانی زنبوران بالغ به‌ویژه زنبوران کارگر از کندوهایی که ذخیره‌ی غذایی کافی و مراحل مختلف نوزاد دارند، نبود زنبوران تلف‌شده در اطراف و داخل کندوها، تأخیر غارت کندوهای تحت تأثیر قرار گرفته توسط آفت‌های ثانویه یا زنبوران دیگر شناسایی می‌شود .
کاهش ناگهانی کلنی‌ها محدود به آمریکا نبوده و از سایر کشورها هم گزارش شده است. نخستین کشور اروپایی درگیر CCD جمهوری ایرلند بود؛ به‌طوری که تا 50 درصد تلفات را در سال 2007 میلادی گزارش کرد و به‌تدریج کشورهای اسپانیا،  پرتغال، ایتالیا، دانمارک و آلمان وجود بیماری را گزارش کردند. در آسیا تایوان نخستین کشوری بود که این بیماری را گزارش کرد، اما امروزه ردپای این پدیده­ در اغلب کشورهای آسیایی مشاهده می‌شود . در ایران نیز از سال 1388 گزارش‌های پراکنده‌ای از کاهش ناگهانی جمعیت کلنی‌های زنبورعسل از مناطق مختلف کشور وجود دارد
از آنجایی‌که توزیع جغرافیایی، فراوانی و وسعت کاهش ناگهانی زنبوران عسل رو به افزایش است، فرضیه‌های مختلفی برای توجیه این پدیده مطرح شده است . اگرچه علت دقیق فروپاشی کلنی‌های زنبورعسل در بسیاری از موارد ناشناخته مانده است، اما عوامل بسیاری به‌عنوان علل آن مطرح می‌باشند، به‌طوری که در سال‌های اخیر مواردی از کاهش جمعیت کلنی به آلودگی با نوزما سرانه نسبت داده شده است . هم‌چنین در برخی مطالعه‌ها اثرات اقلیم بر فروپاشی کلنی‌ها مطرح شده است . بر این اساس، این پژوهش با هدف برآورد شیوع این پدیده در زنبورستان‌ها و بررسی ارتباط آن با آلودگی به گونه‌های نوزما و اقلیم با همکاری دفتر بهداشت و مدیریت بیماری‌های طیور، زنبورعسل و کرم ابریشم سازمان دامپزشکی کشور در تعدادی از زنبورستان‌های کشور انجام شد.

مواد و روش کار
- روش نمونه‌برداری
این مطالعه به‌صورت مقطعی از فروردین تا مهر ماه 1395 به مدت 6 ماه انجام شد. حجم نمونه‌ی مورد نیاز برای انجام این مطالعه با احتساب شیوع CCD برابر 44 درصد (بر اساس مطالعه­ی Mahmodi و همکاران در سال 2011)، سطح معنی‌داری 5 درصد و دقت برابر20 درصد شیوع، 122 زنبورستان بدست آمد. بر اساس نمونه­گیری خوشه­ای هر استان یک خوشه و زنبورستانها بعنوان عناصر خوشه در نظر گرفته شدند. ضریب اثر طرح خوشه­ای( 1/5) در حجم نمونه فوق (122) ضرب و تعداد کل نمونه­ ها 183 زنبورستان برآورد شد. تعداد نمونه­ ها به نسبت زنبورستانهای هر استان به آن اختصاص یافت. از زنبورستان­های استان­های آذربایجان­غربی، خراسان­شمالی، اردبیل، چهارمحال­و­بختیاری، گلستان، خراسان­جنوبی، سمنان، فارس، خراسان­ رضوی، قزوین، قم، کردستان، لرستان، کرمان­ جنوب، گیلان، مازندران و یزد نمونه­ گیری شد .
با استفاده از داده­های سیستم اطلاعات جغرافیایی (داده ­های سازمان دامپزشکی) پراکنش زنبورستانهای مورد مطالعه تعیین و اقلیم زنبورستانهای نمونه­گیری شده بر اساس نقشه طبقه ­بندی اقلیمی دومارتن مشخص شد. به منظور نمونه­گیری، ضمن بازدید کلنی‌های زنبورستان مورد مطالعه توسط کارشناس بیماری‌های زنبورعسل اداره‌های دامپزشکی استان‌ها، اطلاعات مربوط به زنبورستان و مشاهده یا عدم مشاهده­ی علائم CCD در فرم مربوط به هر زنبورستان ثبت شد. سپس بر اساس دستورالعمل سازمان دامپزشکی، به‌صورت تصادفی از 5 درصد کلنی‌های هر زنبورستان نمونه­ی زنبور بالغ اخذ و اطلاعات مربوط به نمونه روی ظروف نمونه‌گیری ثبت شد. نمونه‌ها تحت شرایط سرد برای تشخیص آلودگی به گونه‌های نوزما (نوزما آپیس و سرانه) به آزمایشگاه تشخیص بیماری‌های زنبورعسل مؤسسه­ تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی منتقل شدند.

- آزمایش مولکولی تشخیص اسپور نوزما
آماده‌سازی نمونه‌ها: ابتدا تعداد 20 عدد زنبورعسل از نمونه­ی هر زنبورستان شمارش و جدا شد. سپس قسمت شکمی زنبوران جدا و در mm 10 آب مقطر کاملاً له شد، سوسپانسیون حاصل فیلتر و در 800 دور به‌مدت 6 دقیقه سانتریفیوژ شد.
استخراج DNA : با استفاده از کیت استخراج DNA ساخت شرکت تکاپوزیست مطابق دستورالعمل کارخانه‌ی سازنده DNA استخراج شد.
PCR : غنی‌سازی با استفاده از کیت PCR شرکت سیناکلون بر اساس دستورالعمل OIE در ترموسایکلر ساخت کارخانه­ اپندورف آلمان انجام شد. سپس محصولات PCR با الکتروفورز بر روی ژل آگاروز 1 درصد جدا، رنگ‌آمیزی و با اشعه‌ی ماوراءبنفش مشاهده شد. در این روش از پرایمر اختصاصی 16S rRNA  برای شناسایی نوزما آپیس و نوزما سرانه استفاده شد . کنترل‌های مثبت برای نوزما آپیس و نوزما سرانه در مؤسسه­ تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی تهیه شدند.

- جمع‌آوری و آنالیز داده‌ها
اطلاعات نمونه‌های اخذ شده و نتایج آزمایش مولکولی نمونه‌ها ثبت و داده‌ها با استفاده از آزمون‌ غیر پارامتریک مربع کای تحلیل شدند. تمامی آنالیزهای آماری با نرم‌افزار SPSS نسخه‌ی 21 انجام شد. در تمام آنالیزها (p≤0.05) به عنوان سطح معنی‌داری در نظر گرفته شد.

نتایج
در این مطالعه از تعداد 183 زنبورستان نمونه‌برداری شده، 49 زنبورستان (26/8 درصد ، فاصله‌ی اطمینان 95 درصد : 33/3-20/3) دارای علائم CCD بودند. میزان شیوع فروپاشی کلنی‌های زنبور عسل در اقلیم‌های متفاوت کشور نشان داده شده است. در مقایسه‌ی میزان شیوع CCD با استفاده از آزمون مربع کای، شیوع آلودگی به CCD در مناطق اقلیمی کشور تفاوت آماری معنی‌داری داشت (0.05>p).
بر اساس نتایج آزمایش مولکولی آلودگی با نوزما سرانه در همه‌ی اقلیم‌های مورد مطالعه وجود داشت ، در حالی­که آلودگی با نوزما آپیس در هیچیک از نمونه‌ها مشاهده نشد. شیوع نوزما سرانه در مناطق اقلیمی کشور از نظر آماری تفاوت معنی‌داری داشت (0.05>p).
همان‌طور که در جدول شماره 5 مشاهده می‌شود، بین آلودگی با نوزما سرانه و شیوع CCD ارتباط آماری معنی‌داری دیده نشد (p>0.05) به‌طوری که آلودگی با این انگل شانس ابتلا به پدیده‌ی CCD را تغییر نداده است.

بحث
بر اساس یافته‌های این مطالعه شیوع CCD در زنبورستان‌های مورد مطالعه 26/8 درصد بود. در مطالعه‌ی Mahmodi و همکاران در سال 2011، شیوع فروپاشی کلنی در زنبورستان‌های ایلام 43/3 درصد گزارش شده است . در این مطالعه با توجه به شیوع بیشتر این پدیده در مناطق نیمه خشک (43/8 درصد) و خشک (38/2 درصد) نسبت به سایر مناطق، احتمال تأثیر گرما بر وقوع بیشتر پدیده­ی CCD مطرح است.
بر اساس مطالعه‌‍‌های انجام شده اقلیم محلی که کندو در آن قرار گرفته بر سلامت کندو تأثیر دارد. تغییرات اقلیمی در سطوح مختلف بر زنبورعسل اثر می‌گذارند، این تغییرات ممکن است بر رفتار و فیزیولوژی زنبور تأثیر مستقیم داشته باشد، کیفیت محیط گیاهان را تغییر دهد، توان تولید کلنی را کاهش یا افزایش دهد، توزیع زنبوران را تعیین کند و باعث افزایش رقابت در بین گونه‌ها و نژادهای زنبور و نیز در بین پارازیت‌ها و پاتوژن‌های آن‌ها شود. بنابراین تغییرات محیطی و استرس‌های مربوط به تغییرات اقلیمی ممکن است در فروپاشی کلنی‌ها تأثیر داشته باشند .
بنابر نظر Conte و همکاران در سال 2008 اقلیم بر توزیع محصولات کشاورزی، رشد گل‌ها و تولید شهد و گرده گیاهان اثر می‌گذارد و این‌ها بر فعالیت چرای زنبورها تأثیر می‌گذارند. تغییرات اقلیم می‌تواند روی گسترش و حدت آفت‌ها و پاتوژ‌ن‌ها اثر بگذارد. هم‌چنین حساسیت زنبور عسل به پاتوژن‌ها و پارازیت‌ها تحت تاثیر هوا قرار می‌گیرد؛ مثلاً در زمستان‌های گرم مانند سال‌های 2012-2011 کاهش کلنی‌ها در آمریکا به‌طور قابل ملاحظه‌ای کمتر بوده است .
یافته‌های این مطالعه نشان دهنده‌ی گسترش نوزما سرانه در 85 نمونه از 183 نمونه مطالعه شده (46/4 درصد) و عدم حضور نوزما آپیس است. نوزما سرانه نخستین بار در ایران در سال 2011 میلادی توسط Nabian و همکاران گزارش شد (21). به دنبال آن آلودگی با این انگل  توسط مطالعه‌های  دیگری تأیید شد. به‌طوری که بر اساس یافته‌های Razmaraii و همکاران در سال 2011، نوزما سرانه تنها گونه جدا شده در آذربایجان شرقی بود .
همچنین بر اساس گزارش Modirrousta و همکاران در سال 2014، نمونه‌های جمع آوری شده‌ی 5 استان در فواصل زمانی 2013-2004 از نظر آلودگی به نوزما سرانه مثبت بودند (20). هم‌چنین در مطالعه Aroee و همکاران در سال 2017، آلودگی نمونه‌های زنبورعسل استان‌های اصفهان، چهارمحال و بختیاری و فارس با نوزما سرانه گزارش شده است .
در این مطالعه‎ بیشتر بودن شیوع نوزما سرانه در مناطق نیمه مرطوب (71 درصد) ، خیلی مرطوب (68/2 درصد) و مرطوب (53/8 درصد) نسبت به سایر مناطق می‌تواند بر تأثیر رطوبت در گسترش آلودگی تأکید داشته باشد. نتایج مطالعه‌ی انجام شده در ترکیه نیز نشان می‌دهد نوزما سرانه در مناطقی که رطوبت بالایی دارند، گسترش بیشتری دارد و میزان رطوبت به‌دلیل تأثیر آن بر دما، یک عامل حیاتی برای گونه‌های نوزما توصیف شده است .
در این مطالعه نسبت شانس CCD در زنبورستان‌های آلوده به نوزما سرانه (1/59-0/42) 0/82 با 0/56p=، نشان می‌دهد آلودگی به نوزما سرانه تأثیر آماری معنی‌داری در شانس ابتلا به CCD ندارد. بنابراین آلودگی با نوزما به‌عنوان یک عامل مؤثر بر CCD مطرح نیست. مشابه یافته‌ی اخیر در مطالعه‌ی انجام شده در اردن توسط Haddad  در سال 2011، ارتباطی بین فروپاشی کلنی و نوزما یافت نشده است .
همچنین مطابق مطالعات متعددی نوزما به تنهایی علتCCD  در ایالات متحده امریکا، آلمان و کانادا نبوده است (15). در مطالعه‌ی Cox-Foster و همکاران در سال 2007، CCD با نوزما سرانه ارتباط علیتی نداشته است. در این مطالعه ویروس فلجی حاد اسرائیلی خطر فروپاشی کلنی را افزایش داده (Odds=65)  و تأثیر این ویروس در نمونه‌های آلوده با نوزما آپیس افزایش داشته در حالی­که نوزما سرانه تأثیر ویروس فلجی حاد اسرائیلی را بر CCD تغییر نداده است.
در برخی مطالعه‌ها تأثیر آلودگی به نوزما بر فروپاشی کلنی‌های زنبورعسل گزارش شده است، به‌طور مثال در مطالعه‌ی Mahmodi و همکاران در سال 2011، از 13 زنبورستان دارای علائم CCD، 9 زنبوررستان (69/23 درصد) آلوده به اسپور نوزما بوده، به‌طوری که ارتباط آماری معنی‌داری بین CCD و نوزما وجود داشته است .
بر اساس 3 منبع منتشر شده در مورد کلنی‌های زنبور در اسپانیا، نوزما سرانه در مدت 18 ماه آلودگی کندو، موجب CCD می‌شود (13، 19). اگرچه به‌نظر می رسد نوزما سرانه نقش کلیدی در فروپاشی کلنی در اسپانیا داشته باشد (12) اما جای تعجب است که با وجود نوزما سرانه در قاره اروپا از سال 1998 میلادی، تلفات بیشتری از اروپا گزارش نشده است. بر اساس نظر پژوهشگران ممکن است آپیس ملیفرای اسپانیایی نسبت به سایر نژادهای زنبور به نوزما سرانه حساس‌تر باشد یا سویه‌ی نوزما سرانه‌ی اسپانیا حدت بیشتری داشته باشد .
در مطالعه‌ی دیگری در اسپانیا در 2 زنبورستان واقع در دو منطقه که از نظر آب و هوایی و شرایط پرورش زنبور از جمله نوع پوشش گیاهی موجود برای زنبوران و روش‌های زنبورداری کاملاً متفاوت بودند، خسارت‌های زیاد کلنی با ناپدید شدن زنبوران بالغ در زمستان سال 2006 میلادی گزارش شده است. بر اساس یافته‌های این مطالعه، تنها پاتوژن موجود در همه‌ی نمونه‌های زنبور عسل نوزما سرانه بوده است . همچنین مرگ کلنی‌ها درلهستان، اتریش و فرانسه و کاهش چشمگیر کلنی در اروپای شمالی به وجود نوزما سرانه مربوط بوده است.
امروزه نوپدید بودن نوزما سرانه برای زنبور آپیس ملیفرا و اثرات آن بر کلنی‌ها مشخص است. این‌که این پاتوژن به تنهایی یا همراه سایر عوامل از جمله از بین رفتن سکونت گاه‌های زنبور و کمبود منابع گیاهی موجب فروپاشی کلنی‌ها می‌شود؛ هنوز نامشخص است و نیاز به بررسی‌های بیشتر دارد.

نتیجه‌گ یر ی
بنا به اطلاعات نویسندگان ، این پژوهش نخستین بررسی گسترده‌ی کلنی‌های زنبورعسل در کشور است که شواهدی از پدیده‌ای به‌نام CCD را فراهم نموده است. تأثیر اقلیم بر این پدیده در این پژوهش نیز می‌تواند ناشی از اثرات متقابل عوامل دیگر باشد. به هرحال تغییرات اقلیمی در سال‌های اخیر و تأثیر آن بر منابع چرای در دسترس زنبوران، بر رفتار، عملکرد و بیماری‌های زنبورعسل مؤثر بوده است.
در این مطالعه اگرچه نوزما سرانه در تعدادی از موارد فروپاشی کلنی دیده شد، اما آلودگی با این انگل تأثیر معنی‌داری در شانس ابتلا به CCD نداشت. بنابراین ممکن است نوزما سرانه همراه با سایر انگل‌ها و عوامل بیماری‌زا در فروپاشی کلنی‌ها نقش داشته باشد. هم‌چنین عدم مشاهده نوزما آپیس و پراکنش نوزما سرانه در زنبورستان‌ها می‌تواند نشانه‌ی جایگزینی نوزما سرانه با نوزما آپیس باشد. بر اساس این یافته ها و با توجه به این‌که بر اساس مطالعه‌های اخیر پژوهشگران تأثیر متقابل عوامل محیطی، مدیریتی، پاتوژن‌ها و پارازیت‌ها در پدیده‌ی فروپاشی کلنی محتمل است، بررسی نقش این عوامل در فروپاشی کلنی­ها در زنبورستان‌های کشور مفید خواهد بود.

تشکر و قدردانی
بدین‌وسیله ازهمکاری سازمان دامپزشکی کشور برای انجام هماهنگی‌های لازم برای نمونه‌گیری در استان‌های مختلف قدردانی می‌شود. از تمامی دامپزشکان که در کار فیلدی این مطالعه همکاری نمودند و همه‌ی زنبوردارانی که از زنبورستان‌های آن‌ها نمونه‌گیری شد، تشکر و قدردانی می‌شود. هم‌چنین از زحمات کارکنان آزمایشگاه تشخیص بیماری‌های زنبورعسل مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی به‌دلیل انجام آزمایش‌های مربوط قدردانی می‌شود.

نویسندگان : بهارک محمدیان ، سعید بکایی ، مجتبی محرمی ، صدیقه نبیان ، محمد فرسی